කොවිඩ් 19 ආසාදිතයෙකු හඳුනාගන්නා ආකාරය…

‍කොවිඩ් 19 යනු වෛරසයක් නිසා හට ගන්නා රෝග තත්ත්වයක් වන අතර, ලෝක සෞඛ්‍ය සංවිධානය මෙම වෛරසය SARS-CoV-2 ලෙස නම් කරනු ලබනවා. මෙම වෛරසය සිය ප්‍රවේණික ද්‍රව්‍ය ලෙස තනි දාම RNA අණුවක් දරණ අතර මේ නිසා මෙය RNA වෛරස ඛාණ්ඩයට අයත් වනවා. ‍වෛරසයක් යනු ඉතාම කුඩා අංශුවක් වන අතර මෙය නිරීක්ෂණය කළ හැකි වන්නේ ඉලෙක්ට්‍රෝන අණ්වීක්ෂයකින්ම පමණි. මේ හේතුව නිසාම වෛරස රෝගී තත්ත්වයන් නිෂ්චය කිරීම තරමක් භාරදූර කාර්යයක් වන අතර බොහෝවිට ඒ සඳහා වෛරසයේ ප්‍රවේණික ද්‍රව්‍ය අණුක ජීව විද්‍යාත්මක ක්‍රම භාවිතා කරනු ලබනවා. මෙම ලිපිය මඟින් දැනට මෙම කොවිඩ් 19 ආසාදිතයෙක් හඳුනා ගැනීම සඳහා භාවිතා කරන ක්‍රම පිළිබඳ විද්‍යාත්මක සොයා බැලීමක් සිදු කිරීමට කරනු ලබනවා.

ලොවපුරා කොරෝනා ආසාදිතයින් හඳුනාගන්නා ප්‍රධාන ආකාර දෙකකි…

⦁ Rapid tests (antigenic and serological) හෙවත් වේගවත්
පරීක්ෂන මගින්

⦁ Molecular Diagnostic Assays (Real Time RT-PCR) හෙවත්
අණුක රෝග විනිශ්චය පරීක්ෂණ

𝐑𝐚𝐩𝐢𝐝 𝐭𝐞𝐬𝐭𝐬 (𝐚𝐧𝐭𝐢𝐠𝐞𝐧𝐢𝐜 𝐚𝐧𝐝 𝐬𝐞𝐫𝐨𝐥𝐨𝐠𝐢𝐜𝐚𝐥) – වෛරසයට එරෙහිව සිරුර තුල නිපදවෙන ප්‍රතිදේහ හඳුනා ගැණීමේ පරීක්ෂාව

සාමාන්‍යයෙන් ඕනෑම රොග කාරකයෙක් අප සිරුරට ඇතුළු වූ විට අප සිරුරේ ප්‍රතිෂක්තිකරණ පද්ධතිය හා සම්බන්ධ සුදු රුධිරාණු මඟින් එම රෝග කාරකයට පමණක් බැඳිමේ හැකියාව ඇති විශේෂිත ප්‍රෝටීනයක් නිපදවනු ලබයි. මෙම ප්‍රෝටීන හඳුන්වනු ලබන්නේ ප්‍රතිදේහ (Antibody) ලෙසයි. මෙම ප්‍රතිදේහ රුධීරයට කෙලින්ම මුදා හැරෙන අතර මෙවා හඳුනා ගැනීම මගින් අදාළ රෝග කාරකය ශරීරගතවී ඇති බව සනාථ කරගත හැක.

මෙම පරීක්ෂණයේ සංකල්පය ගර්භණී බව නිර්ණය කරන HCG හෝමෝන පරීක්ෂණ ක්‍රියාත්මක වන ආකාරය හා සමාන වේ.

surescreen ආයතනය මගින් නිපදවා ඇති RAPID කොවිඩ් 19 පරීක්ෂණ තීරුවක් (ඡායාරූපය – https://www.surescreen.com/ )

මෙම පරීක්ෂණ RT-PCR පරීක්ෂණවලට වඩා විශ්වසනීයබව අඩුය. නමුත් මිල අධික උපකරණ අවශ්‍යතාවයකින් තොරව හෝ ක්ෂේත්‍රයේදීද සිදු කළ හැකිය. මෙහිදී විශේෂ පරීක්ෂණ තීරු භාවිතා වන අතර එය මතට එකතු කරනු ලබන රුධිරය බිඳුවක කොවිඩ් 19 රෝග කාරකයට එරෙහිව ප්‍රතිදේහ නිපදවී ඇත්නම් වර්ණ වෙනසක් ලබා දේ. ඒ අනුව විනාඩි 10ක් වැනි සුළු කාලයක් තුල මේ පරීක්ෂාවේ ප්‍රතිඵල ලබා ගත හැක.

මෙම පරීක්ෂණ මිනිත්තු 10-30 කින් සහ විශාල රසායනාගාර වලින් බැහැරව කළ හැකි නමුත් ඒවා විශ්වාසදායක මිනුම් ලබා දීම සඳහා විශ්ලේෂණයේ ප්‍රතිදේහ සාන්ද්‍රණය ඉහල අගයක් ගත යුතුය. මෙයින් අදහස් කරන්නේ මෙම වර්ගයේ පරීක්ෂණ බොහොමයක් ක්‍රියාත්මක විය හැක්කේ රෝග ලක්ෂණ සහිත පුද්ගලයින් තුළ පමණක් බවයි.‍මේ හේතුව නිසාම RT-PCR පරීක්ෂණවලට වඩා විශ්වසනීයබව අඩු බැවින්, දන්නා පරිදි මෙය ලංකාවේ බොහොමයක් රටවල තවමත් භාවිතා නොවේ.

𝐌𝐨𝐥𝐞𝐜𝐮𝐥𝐚𝐫 𝐃𝐢𝐚𝐠𝐧𝐨𝐬𝐭𝐢𝐜 𝐀𝐬𝐬𝐚𝐲𝐬 (𝐑𝐓-𝐏𝐂𝐑) හෙවත් අණුක රෝග විනිශ්චය පරීක්ෂණ

real time RT-PCR තාක්ෂණය ඉතා සංවේදී හා විශේෂිත වන අතර සාමාන්‍යයෙන් රසායනාගාරයක් තුල පැය 6 ත් 8 ත් අතර කාලයක් ගත වුවද, විශ්වාසදායක රෝග විනිශ්චයක් පැය තුනක් තරම් අඩු කාලයකින් වුවද ලබා දිය හැකිය. දැනට භාවිතයේ ඇති වෙනත් වෛරස වෙන්කර ගැනීමේ ක්‍රම සමඟ සසඳන විට, real time RT-PCR සැලකිය යුතු වේගයකින් යුක්ත වන අතර contamination(අපවිත්‍රණය) හෝ errors(වැරදි රෝග විනිශ්චයන්) සඳහා අඩු විභවයක් ඇත. කෙ‍ාරෝනා වෛරසය හඳුනා ගැනීම සඳහා ලබා ගත හැකි වඩාත් නිවැරදි ක්‍රමය මෙයයි.

PCR පරීක්ෂණය යනු ජීවී සෛල තුල අඩංගු වන DNA නම් ප්‍රවේණික දත්ත ගබඩා කරන රසායනිකය හඳුනා ගැනීම සඳහා සිදු කරනු ලබන අණුක මට්ටමේ පරීක්ෂාවකි. මෙහිදී ජීවී සාම්පල වලින් වෙන් කරගන්නා DNA සාම්පල කිසියම් නිශ්චිත Primer එකක් භාවිතා කර ගුණනය කරනු ලබනවා. මෙම Primer එක හා සමපාත වන DNA අදාළ සාම්පලයෙහි නොතිබුන හොත් මෙම ගුණනය වීම සිදුවන්නේ නැහැ. මේ අනුව අප භාවිතා කරන Primer එක මඟින් කිසියම් නිශ්චිත රෝග කාරකයෙකු ගේ DNA හඳුනා ගැනීම සිදු කල හැකියි.

නමුත් මෙම කොවිඩ් 19 රෝග කාරක වෛරසය වන SARS CoV 2 වෛරසය RNA වෛරසයක් නිසා සරල PCR පරීක්ෂාවක් මඟින් මෙම වෛරසය හඳුනා ගත නොහැකියි. එම නිසා ඒ සඳහා තවත් අමතර පියවරක් එක්කරන ලද PCR පරීක්ෂාවක් මේ සඳහා යොදා ගන්නවා. මේ අමතර පියවරෙහිදී සිදු කරන්නේ වෛරස වල අඩංගු RNA අණු Reverse Transcriptase නැමති එන් සයිමය භාවිතා කරමින් DNA බවට හරවා ගැනීමයි. අනතුරුව මෙසේ නිපදවා ගත් DNA හෙවත් Complimentary DNA/cDNA අදාළ Primer එක භාවිතා කරමින් PCR පරීක්ෂාව වෙත යොමු කරනවා. මේ නිසා මෙම විශේෂිත පරීක්ෂාව හඳුන්වනු ලබන්නේ RT-PCR පරීක්ෂාව ලෙසයි.

දැනට ලංකාවේ සියලුම වෛරස හඳුනාගැනීමේ රස‍ායනාගාර වල භාවිතාවන ක්‍රම‍වේදය මෙය වන අතර අණුක රෝග විනිශ්චය පරීක්ෂණ මගින් SARS-COV-2 (COVID-19 සඳහා වගකිව යුතු වෛරසය) සඳහාම විශේෂිත වූ වෛරස් RNA හඳුනා ගැනීම අරමුණු කරයි.

මේ සඳහා ලංකාවේ PCR තාක්‍ෂණය මත පදනම් වූ අනාවරන පද්ධති (Detection system) දෙකක් භාවිතා වේ. එනම්,

1. 2019-𝘯𝘊𝘰𝘷 𝘊𝘋𝘊 𝘥𝘦𝘵𝘦𝘤𝘵𝘪𝘰𝘯 𝘴𝘺𝘴𝘵𝘦𝘮 (𝘐𝘋𝘛, 𝘜𝘚𝘈)
2. 𝘙𝘦𝘢𝘭𝘚𝘵𝘢𝘳® 𝘚𝘈𝘙𝘚-𝘊𝘰𝘝-2 𝘙𝘛-𝘗𝘊𝘙 𝘒𝘪𝘵 1.0 (𝘈𝘭𝘵𝘰𝘯𝘢 𝘥𝘪𝘢𝘨𝘯𝘰𝘴𝘵𝘪𝘤𝘴‐𝘎𝘦𝘳𝘮𝘢𝘯𝘺)

මෙම අනාවරක පද්ධති (Detection system) දෙකම Avon Pharmo Chem ආයතනය විසින් අදාල සියලු රසායනාගාර වෙත බෙදාහරිනු ලබයි.

ඉහත රූපසටහනේ දැක්වෙන පරිදි මෙම පරීක්ශාවේ ක්‍රියා පිලිවෙල පහත පරිදි දැක්විය හැක. මුලින්ම සැක කළ පුද්ගලයාගේ නාසයෙන් හෝ උගුරෙන් නියැදියක් ලබා ගන්නා අතර නියැදිය න්‍යෂ්ටික අම්ල නිස්සාරණය (nucleic acid extraction) එනම් RNA කොටස වෙන්කරගැනීම හා ගුණනය (amplification) සඳහා සකස් කරනු ලැබේ.

අපට මෙම ක්‍රියාවලිය පියවර දෙකකට බෙදිය හැකිය

1. RNA extraction (RNA නිස්සාරණය)

2. RNA, අනුපූරක DNA (cDNA) බවට පිටපත් කිරීම හා PCR
ගුණනය කිරීම (Reverse Transcription and PCR
amplification)

𝙍𝙉𝘼 𝙚𝙭𝙩𝙧𝙖𝙘𝙩𝙞𝙤𝙣 (RNA නිස්සාරණය)

මෙම RNA අණු වෙන්⁣කර ගැනීමේ ක්‍රියාවලියද මූලික පියවර තුනකි.

(1) ජීරණය කිරීම (Lysis)

(2) න්‍යෂ්ටික අම්ලය සිලිකා ජෙල් පටලයට බන්ධනය කිරීම (bind)

(3) සිලිකා ජෙල් පටලයට බැඳී ඇති RNA සේදීම සහ ඉවත් කිරීම (wash and elute)

වෛරස සාම්පලයකින් RNA වෙන් කර ගැනීම
(1) ජීරණය කිරීම (Lysis)
මෙහිදී සෛල පටල බිඳ හෙලා න්‍යෂ්ටික අම්ලය නිදහස් කරගනු ලැබේ.
(2)/(3) න්‍යෂ්ටික අම්ලය සිලිකා ජෙල් පටලයට බන්ධනය කිරීම (bind)
න්‍යෂ්ටික අම්ල බන්ධනය කරගැනීම (bind) සඳහා, ස්වාරක්ෂක ද්‍රාවණයක් (binding solution) සාම්පලයට එකතු කර කේන්ද්‍රාපසාරණය (centrifuge) කරගනු ලැබේ. එවිට RNA සිලිකා ජෙල් පටලය සමග බන්ධනය වේ.
(4) සිලිකා ජෙල් පටලයට බැඳී ඇති RNA සේදීම සහ ඉවත් කිරීම (wash and elute)
RNA පටලයට බැඳී ඇති අතර, අපවිත්‍ර ද්‍රව්‍ය විවිධ සේදුම්කාරක භාවිතා කරමින් පියවර දෙකකින් කාර්යක්ෂමව සෝදාහරිනු ලැබේ.
(5) ඉවත් කිරීම (elute) සඳහා, wash buffer ඉවත් කර elution buffer (හෝ සරලව ජලය) එකතු කර කේන්ද්‍රාපසාරණය (centrifuge) කරගනු ලැබේ. elution buffer මගින් පටලයෙන් RNA ඉවත් කරන අතර RNA නලය පතුලට එකතු වේ.

RNA පිරිසිදු කර වෙන්කරගැනීම සඳහා SpinStar™ Viral Nucleic Acid Kit හා QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini Kit ප්‍රතික්‍රියාකාරක පද්ධති ලංකාවේ බහුලව භාවිත වේ.

𝙍𝙚𝙫𝙚𝙧𝙨𝙚 𝙏𝙧𝙖𝙣𝙨𝙘𝙧𝙞𝙥𝙩𝙞𝙤𝙣 𝙖𝙣𝙙 𝙋𝘾𝙍 𝙖𝙢𝙥𝙡𝙞𝙛𝙞𝙘𝙖𝙩𝙞𝙤𝙣
(RNA අණු cDNA බවට පිටපත් කිරීම හා PCR ගුණනය කිරීම)

ඇමරිකාවේ IDT ආයතනය මගින් නිපදවන කොවිඩ් 19 අනාවරක පද්ධතිය ක්‍රියා කරන ආකාරය
1. සැක සහිත ආසාදිතයින්ගේ සෙම පටල සාම්පල ලබා ගැනීම 2. සාම්පලයන් හී අඩංගු ජීවී කොටස් වල ප්‍රවේණික ද්‍රව්‍ය වෙන් කර ගැනීම 3. Reverse Trancriptase එන්සයිමය මගින් RNA – DNA බවට පරිවර්තනය කරගැනීම 4. PCR පරීක්ෂාව මඟින් DNA ගුණනය කරගැනීම 5. පරීක්ෂාවේ වර්ණ විපර්යාසයන් මඟින් වෛරසය සහිත සාම්පල හඳුනා ගැනීම 6. පරීක්ෂණ සාම්පලයන් හී වර්ණ විපර්යාසයන් සජීවීව නිරීක්ෂණය සඳහා භාවිතා කරන විශේෂිත යන්ත්‍රය 7. IDT Primers – PCR ප්‍රතික්‍රියාවේදී කොවිඩ් 19 වෛරස DNA ගුණනය ආරම්භ කරයි 8. IDT Probes – කොව්ඩ් 19 වෛරස DNA හා බැඳී ප්‍රතිදීප්ත වර්ණ විපර්යාසයක් ලබා දේ.

පළමුව RNA අණු අනුපූරක DNA බවට පරිවර්තනය කරන අතර පසුව එම DNA අනුපිළිවෙල තථ්‍ය කාලීන පොලිමරේස් දාම ප්‍රතික්‍රියා (Real Time PCR) මගින් ගුණනය කරනු ලැබේ.

Real Time PCR එකකදි, අප විසින් SARS-COVID-19 සඳහාම සුවිශේෂි වූ probe strand එකතු කරගනු ලැබේ.

මෙම probe strand ක් සතුව ප්‍රතිදීප්ත සායම් (dyes) දෙකක් අඩංගු වේ. ඒවා වාර්තාකිරීමේ (Reporter) සහ නිවාදැමීමේ (Quencher) ක්‍රියාව ඉටුකරයි. මේ දෙක එකට පවතින විට කිසිඳු ප්‍රතිදීප්ත සංඥානක් නිකුත් නොකරන අතර, වෙන් වූ විට ප්‍රතිදීප්ත සංඥා නිකුත් කරයි.

මෙම probe strand ඉදිරි හා ප්‍රතිලෝම primers අතර පිහිටා ඇති SARS-COVID-19 ජානය සම්බන්ධ වේ. PCR චක්‍රයේ විස්තාරණ අවධියේදී (extension phase), පොලිමරේස් මගින් බැඳී ඇති probs කොටස් වලට වෙන්වන අතර, reporter සායම් quencher සායම් වලින් වෙන් කිරීමට හේතු වන අතර එහි ප්‍රතිපලයක් ලෙස ප්‍රතිදීප්ත සංඥාව වැඩි වේ.

අපේක්ෂිත සීමාවට (threshold limit) වඩා ඉහළින් ඇති ප්‍රතිදීප්ත නිශ්චිත සීමාවක් ඉක්මවා ගියහොත් පරීක්ෂණය ධනාත්මක (Positive) වේ. නියැදිය තුළ වෛරසය නොතිබුනේ නම්, PCR පරීක්ෂණයෙන් පිටපත් නොතිබෙනු ඇත, එබැවින් ප්‍රතිදීප්ත අපේක්ෂිත සීමාවට ළඟා නොවේ – පරීක්ෂණය සෘණාත්මක (Negative) වේ. (පස්වන ඡායාරූපය)

පරීක්ෂණයේ වලංගුභාවය සනාථ කිරීම සඳහා අභ්‍යන්තර ධනාත්මක (Internal positive controls (SARS-COV-2 RNA අඩංගු බව දන්නා සාම්පල) සහ සෘණාත්මක පාලනයන් (Negative controls) සමාන්තරව ක්‍රියාත්මක වේ.

ශ්‍රී ලංකාවේ දැනට මූලිකව මෙම කොවිඩ් 19 රෝගය ආසාධිත පුද්ගලයින් හඳුනාගැනීම සඳහා භාවිතා වන්නේ RT-PCR පරීක්ෂාව වන අතර ප්‍රතිදේහ හඳුනාගැනීමේ RAPID පරීක්ෂාවන් තවමත් පුළුල් මට්ටමින් භාවිතා කිරීමක් සිදුවන්නේ නැහැ.

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *

This site uses Akismet to reduce spam. Learn how your comment data is processed.